発生やiPS化を表す「地形」を細胞内にプログラミング

東京工業大学大学院総合理工学研究科の木賀大介准教授（JSTさきがけ研究者兼任）と関根亮二院生らは、合成生物学（用語1）の手法を用い、生命の発生や人工多能性幹細胞（iPS）化を表す「地形」を細胞内にプログラミングし、細胞の状態変化をデザインする新規な手法を打ち立てることに成功した。木賀准教授らは生きた細胞内に、人工的に組み合わせた遺伝子のネットワークを導入し、この細胞が細胞内・細胞間の遺伝子相互作用の結果により多様な細胞へと、設計どおりに分岐していくことを確認した。従来、受精卵という１つの細胞から多様な細胞が生じる発生の過程は「ワディントン地形」という、下るほど谷の数が増えてゆく地形の上を玉が転がることで説明されてきた（図１）。京都大学山中教授は、iPS細胞の概念を説明するために、この地形上を玉が登っていく図を示している。

東京工業大学大学院総合理工学研究科の木賀大介准教授（JSTさきがけ研究者兼任）と関根亮二院生らは、合成生物学（用語1）の手法を用い、生命の 発生や人工多能性幹細胞（iPS）化を表す「地形」を細胞内にプログラミングし、細胞の状態変化をデザインする新規な手法を打ち立てることに成功した。木 賀准教授らは生き た細胞内に、人工的に組み合わせた遺伝子のネットワークを導入し、この細胞が細胞内・細胞間の遺伝子相互作用の結果により多様な細胞へと、設計どおりに分 岐していくことを確認した。従来、受精卵という１つの細胞から多様な細胞が生じる発生の過程は「ワディントン地形」という、下るほど谷の数が増えてゆく地 形の上を玉が転がることで説明されてきた（図１）。京都大学山中教授は、iPS細胞の概念を説明するために、この地形上を玉が登っていく図を示している。 しかし、この「地形」モデルの実態は解明されていなかった。 今回の人工遺伝子ネットワークと同じ構造を生物の中から見つけだすことで、発生や再生過程に関する新たな知見を得ることが期待される。また、今回開発した プログラミング法は、微生物を活用した有用物資生産や再生医療への応用が予想される重要な方法論である。 この成果は、「米国科学アカデミー紀要」のオンライン速報版で2011年10月24日（米国東部時間）の週に公開される。

生命の発生や再生プロセスにおいて重要な、細胞内・細胞間の遺伝子相互作用によって生じる細胞種の多様化は、下に行くほど溝の数が増えていく坂道を玉が転 がる様子で抽象的に解釈されている。この坂道は「ワディントン地形」（Waddington’s landscape）と呼ばれ、最上部が受精卵、最下部のそれぞれの溝が、筋肉や神経など安定な細胞状態に対応している（図１）。京都大学の山中伸弥教授 はiPS細胞の概念を説明するために、この地形上を玉が登っていく図を示している。 地形モデルは、複雑な生命現象を把握するために有用であるが、実態は解明されていなかった。「地形」の単純な概念に対して、天然の細胞種の多様化に関わ る遺伝子数は膨大で、細胞種の多様化に関わる遺伝子ネットワークのうちどこがコアな部分なのかを調べるのは困難である。このため、細胞の状態変化をデザイ ンすることも難しかった。 近年進展している合成生物学という研究手法は、自然現象を司る遺伝子ネットワークのコアな相互作用を調べるための有力な手法であり、その研究過程で、自 然現象における相互作用を再構成した規模の小さいシステムである人工遺伝子ネットワークが構築される。本研究では、細胞間の相互作用を変化させる実験操 作が「地形」に与える影響を考慮することで、細胞集団の運命をデザインどおりに変化させることができた。

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  図1 Waddington’s landscape。１つの細胞から、神経細胞、筋細胞など多様な安定状態へと細胞が分化する過程を示す。細胞の分化は、下るほど溝の数が増 えてゆく地形の上を玉が転がることで表現されてきた。この図において、細胞のiPS化とは、山を下りきった（分化しきった）細胞がもう一度上に登ることに相当する。

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  図2 Waddington’s landscape 上を転がる玉のように、同一の細胞集団が２つの安定状態に多様化する挙動の概念図。開発した人工遺伝子ネットワークを持った大腸菌を、(1)通信分子が少 ない環境でlow状態のみにすると、(2)わずかに細胞間通信分子を生産しながらhigh状態に近づく。じゅうぶんに細胞間通信分子の濃度が高まると、両 方の状態が安定となるので、(3)細胞集団の分布の一部がhigh 状態に向かい、(4)残りがlow 状態に戻る。そして、最終的に２つの細胞種が混ざった状態として安定する。

今回の研究では、均一な細胞集団が「ワディントン地形」上を転がる玉のように２つの細胞種に多様化する機能を、４つの遺伝子からなるシンプルな人工遺伝 子ネットワークを設計し、これを生きた細胞に導入することで実装した（図2）。転がる過程で、細胞同士は自らが生産する細胞間通信分子（AHL、用語2）によ って相互作用を行うように設計した。この人工ネットワークの機能は、図3 で表わされるように、２つの遺伝子を利用した細胞間通信と、さらに別の２種類の遺 伝子(LacI、CI_ts）による細胞内での相互抑制とからなる（用語3）。 この結果、同一の遺伝子セットを持つ細胞が、細胞間通信分子を生産する「high状態」と、わずかしか生産しない「low 状態」の２つの細胞種に多様化できる。 今回は、各細胞種の認識のために、low 状態の細胞が緑色蛍光タンパク質（GFP）を生産するように人工遺伝子ネットワークを設計した。本細胞集団について、low 状態だけであったのが、high 状態とlow 状態という２つの細胞種を含む集団へ変化することを実験で確認した（図4）。

本研究では、試験管内の細胞数を変化させる操作が、細胞間の相互作用の結果を表す「地形」の傾きを操作することに対応する。なぜならば、この細胞数の変化 は、試験管内全体での通信分子の生産速度の変化に対応し、この通信分子の生産速度が地形の縦方向の傾きに対応するためである。「地形モデル」は、この傾き の操作によって多様化後の細胞種の比率が変化することを示している。実際に細胞数を変化させたところ、多様化後の細胞種の比率を、モデルの予想通りに操作 することができた。このことから、天然の細胞種の多様化に関わる遺伝子ネットワークのコアなネットワーク構造の候補を提案した。

図3 high 状態、low 状態の細胞における遺伝子の相互作用の様子。今回開発された人工遺伝子ネットワークは、LacI とCI_tsの細胞内相互抑制と、通信分子AHL による細胞間相互作用からなる。AHL がじゅうぶん存在するとLacI とCI _tsの細胞内相互抑制の効果によりどちらの状態も安定であるが、AHLが欠乏するとlow状態は不安定になる。（左）high 状態の細胞内では、LacI 生産が優勢になっている。また、この状態の細胞はAHL を多く生産する。（右）low 状態の細胞内では、CI_ts生産が優勢となっている。CI_tsは、LacI と同時にAHL を生産するための酵素をコードする遺伝子も抑制するため、この状態ではAHL の生産はわずかである。

図4
実験による多様化の確認。今回開発された人工遺伝子ネットワークはlow状態の細胞がGFPを生産するように設計されている。
low状態にリセットされた 細胞集団は設計通りGFPを多く生産した。
その後、中間状態を経て、low 状態と、GFPをほとんど生産しないhigh状態とに多様化した。

本研究で構築した人工遺伝子ネットワークを持つ細胞でみられた、多様化後の細胞種の比率が細胞数に依存するという相関 は、発生中の胚におけるコミュニティー・エフェクト（Community effect）でもみられる。近年では、ES 細胞の分化比率も、細胞数に依存してしまうことが発見されている。本研究の人工遺伝子ネットワークは４つという少ない数の遺伝子からなるので、同じネット ワーク構造を、発生や再生過程で働いている遺伝子群の中から見つけだすことができるだろう。その結果、発生や再生過程での細胞数に依存した現象に関する新 たな知見を得ることと、この知見を活用して細胞の分化比率の操作が可能になることが期待される。 合成生物学での人工遺伝子ネットワークの構築によって、細胞内・細胞間の相互作用をプログラミングすることにより、微生物を用いた有用物質生産や、再生 医療やiPS細胞の活用に向けた幹細胞の分化誘導などが可能になると期待されている。木賀准教授らが開発した人工遺伝子ネットワークでは、遺伝子型が同一 な 細胞集団における細胞種の比率を制御することができる。このような集団レベルでの挙動制御を伴う分業システムを実現することで、産業・医療応用における重 要な役割を果たすことが予想される。例えば、薬剤や燃料などを微生物で作成するには、複数段階の反応が必要となる。このような場合、１つの細胞で全ての反 応を行うよりも、複数種類の細胞で分業を行うことが望ましいと考えられている。 また、薬物動態予測のために、iPS 細胞から試験管内で微小肝組織を作成する際にも、細胞種の比率制御が重要になってくる。さらに、「地形」に基づいたプロ グラミングの考え方を、ES 細胞やiPS 細胞を助ける細胞のデザインに活かすことで、再生医療に貢献すると期待される。

米国科学アカデミー紀要 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)

1. 論文名

   Tunable synthetic phenotypic diversification on Waddington’s landscape through autonomous signaling ワディントン地形に沿った、自律的なシグナル分 子の生産を介した調節可能な細胞表現型の多様化

2. 著者

   Ryoji Sekine, Masayuki Yamamura, Shotaro Ayukawa, Kana Ishimatsu, Satoru Akama,Masahiro Takinoue, Masami Hagiya, Daisuke Kiga

JST 戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ）「生命現象の革新モデルと展開」研究領域（研究総括：重定南奈子 同志社大学 文化情報学部文化情報学科特別客員教授）における研究課題「細胞間相互作用により双安定状態を維持する人工遺伝子回路の解析」（研究者：木賀大介、研究期 間：2008年～2011年度）文部科学省・日本学術振興会 科学研究費補助金