新規緑色蛍光タンパク質型グルコースセンサーを開発

要点

• グルコースの細胞内での挙動を光学顕微鏡で可視化観察できるセンサーを開発
• 3種の反応性が異なるセンサーを使い分け、広い濃度範囲のグルコースを検出
• デュアルカラーイメージング、線虫個体内でのin vivoイメージングを達成

概要

東京工業大学 科学技術創成研究院 化学生命科学研究所の北口哲也准教授は東京大学 大学院総合文化研究科の坪井貴司教授、三田真理恵大学院生らと共同で新規緑色蛍光タンパク質型グルコース（ブドウ糖）センサー「Green Glifon^[用語1]」の開発に成功した。センサーは緑色蛍光タンパク質^[用語2]を基盤とし、グルコース添加により蛍光輝度が約7倍に上昇する。このセンサーは細胞内グルコースの動態を高い時空間分解能で検出でき、バイオイメージングの有効なツールとなる。

今回開発したセンサーはグルコースへのEC₅₀^[用語3]値が異なる3タイプ（50 μM、600 μM、4,000 μM）からなり、これらの使い分けで生理的な濃度域である数百μM～10数mMのグルコース濃度変化のほとんどを検出できる。そして、細胞内のグルコース動態に加え、細胞小器官特異的な可視化やカルシウムイオンとの同時可視化も実現した。また細胞だけでなく、線虫個体内のグルコース動態も可視化できることから、in vivo^[用語4]イメージングにも適用できる。人工甘味料^[用語5]とグルコースとの生理学的な相関を検討し、膵β細胞^[用語6]への人工甘味料投与が細胞内のグルコース動態を攪乱させる可能性を見出した。

以上の結果から、開発した3タイプのセンサーは生細胞のリアルタイムなグルコース動態の観察を可能にし、細胞のエネルギー動態やその破綻による病態を解析するうえで、重要なツールになると期待される。

研究成果は「Analytical Chemistry（アナリティカル・ケミストリー）」オンライン版にて3月14日に公開された。

研究成果

北口准教授らは緑色蛍光タンパク質を基盤とした3種のグルコースセンサー （Green Glifon）を開発し、それらを利用した生細胞内グルコース動態の可視化に成功した。Green Glifonは分割した緑色蛍光タンパク質（Citrine）の間に、グルコース結合ドメイン配列を融合した構造を持つ（図1A）。

蛍光タンパク質とグルコース結合タンパク質をつなぐ、リンカー領域^[用語7]の長さとアミノ酸配列を最適化することにより、グルコース添加時の蛍光輝度が約7倍に上昇した（図1B）。さらに、グルコース結合ドメインへ変異を導入することで、グルコースへの反応性が異なる3種の変異体を獲得することに成功した。3種のGreen GlifonのEC₅₀値はそれぞれ50 μM、600 μM、4,000 μMであり（図1C）、濃度依存曲線の直線化の範囲から、8 μMから15 mMまでの濃度のグルコースを定量性高く検出できることが判明した。

Green Glifonをヒト子宮頸がん細胞株HeLa（ヒーラ）細胞に遺伝子導入し、細胞外にさまざまな濃度のグルコースを投与すると、その濃度に応答したGreen Glifonの輝度変化が見られた（図2）。さらに、細胞膜、核、ミトコンドリアへの局在化シグナルを融合したGreen Glifonによって、細胞小器官特異的なグルコース動態を可視化できた（図3A）。そしてGreen Glifonは、生きている線虫体内でも発現し、グルコース特異的な蛍光輝度変化を示したことから、in vivoイメージングへの適用が可能であることも示された（図3B）。

また、マウス膵β細胞株であるMIN6 m9細胞に、Green Glifonと赤色カルシウム蛍光指示薬「Rhod2」を共導入し、グルコース刺激を与えると、両者の蛍光輝度の上昇を捉えることができた（図4）。この結果から、グルコースとカルシウム動態の2色同時可視化も可能であることが分かり、マルチカラーイメージングへの適用が期待された。

最後に、インスリン分泌を司る膵β細胞の細胞株であるMIN6 m9細胞に人工甘味料を投与すると、細胞内グルコース濃度が上昇することが示唆された（図5）。この反応は、細胞外にグルコースがない条件では見られず、人工甘味料が膵β細胞内へのグルコース取り込みを促進させ、細胞内恒常性を攪乱させる可能性が示された。

背景

グルコース（ブドウ糖）は細胞の成長や増殖、血糖を調節するインスリンの分泌反応など、さまざまな生命活動や恒常性維持において重要な役割を果たしている。細胞内グルコースの動態は、細胞内の酵素の状態や細胞外からの刺激によってダイナミックに変化し、その代謝は、さまざまな生体反応の原動力となる分子を作り出す。

そして、グルコース代謝の破綻はホルモン分泌の異常を含むさまざまな細胞生理機能の変化を引き起こし、糖尿病を代表とした代謝疾患や神経障害など、個体レベルの病態にも深く関与する。したがって、細胞や個体におけるグルコース動態を明らかにすることはエネルギー代謝に関わる細胞生理機能だけでなく、病気の原因も明らかにできる可能性が高いと考えられる。

グルコース動態やそれを制御する関連分子の動態を、生きた細胞内で詳しく解析するためには、蛍光タンパク質を利用した分子センサーによる生細胞イメージングが有効であり、時空間分解能および汎用性が高いセンサーの開発が待ち望まれていた。

研究の経緯

蛍光タンパク質を利用した分子センサーはフォルスター共鳴エネルギー移動（Förster resonance energy transfer, FRET）型^[用語8]と単色蛍光型の2種に大きく分けられる。以前に開発されていたFRET型のグルコースセンサーにより細胞内のグルコース動態の可視化は達成されていた。しかしながら、1つの検出分子に対し、2種類の蛍光を検出する必要があるという構造的なデメリットを抱えており、分子間の機能相関や階層性を検討するマルチカラーイメージングには不向きだった。一方、北口准教授らの研究グループとほぼ同時期に開発された単色蛍光型グルコースセンサーは、哺乳類由来の細胞内や生体内でのグルコース動態の可視化には適用されていなかった。

今後の展開

今回、開発したグルコースセンサー Green Glifonは、従来の技術では実現が難しかった、生細胞におけるグルコースと異なる分子の同時可視化を可能にし、マルチカラーイメージング技術への応用が期待された。そして細胞レベルだけでなく、生物個体での可視化解析が可能なことから、グルコース代謝を制御する分子基盤、エネルギーの恒常性を維持する機構、その機構の破綻による病態の解明への貢献が期待される。

論文情報

掲載誌 :	Analytical Chemistry
論文タイトル :	Green fluorescent protein-based glucose indicators report glucose dynamics in living cells
著者 :	Marie Mita#, Motoki Ito#, Kazuki Harada, Izumi Sugawara, Hiroshi Ueda, Takashi Tsuboi＊, Tetsuya Kitaguchi＊（#共同筆頭著者、＊共同責任著者）
DOI :	10.1021/acs.analchem.9b00447

• プレスリリース 新規緑色蛍光タンパク質型グルコースセンサーを開発 ―リアルタイムで細胞内グルコースの動態を可視化―
• 生命活動の燃料「ATP」を観察する3色の蛍光センサーの開発に成功｜東工大ニュース
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