東工大ニュース
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公開日:2019.04.22
東京工業大学 科学技術創成研究院 化学生命科学研究所の山科雅裕博士研究員(当時、現・理学院 化学系 助教)と吉沢道人准教授らは、水中で分子カプセルがステロイド性ホルモンの混合物の中から、男性ホルモンを選択的に捕捉できることを発見した。また、分子カプセルと蛍光色素を組み合わせることで、極微量の男性ホルモンの蛍光センシングにも成功した。本成果は人工のカプセル分子による初の超高感度な男性ホルモンの検出法であり、性ホルモンの生理活性機構の解明やドーピングの新検出剤の開発などが期待される。
酵素のタンパク質ポケットによる生体分子の選択的な捕捉は、続く生理活性や酵素反応を決定付ける重要な第1ステップである。生体のステロイド性ホルモンは、わずかな分子構造の差で異なる生理活性を誘導し、その役割によって男性と女性ホルモンに大別される。生体ポケットはこれらの性ホルモンを厳密に識別できるが、従来の合成レセプターでは識別できなかった。
本研究では、同グループが作製した分子カプセルが、種々のステロイド性ホルモンを水中で効率良く取り込むことを見出した。注目すべきは、そのカプセルが類似の構造を持つ男性と女性ホルモンの混合物から、男性ホルモンのみを識別して捕捉できたことである。そのメカニズムとして、剛直なカプセル骨格が内包したホルモンの形状に誘起されて構造変化し、多点の分子間相互作用が働くことが判明した。さらに、あらかじめ蛍光色素を捕捉させた分子カプセルを用いることで、交換反応によりナノグラム量の男性ホルモンの蛍光検出にも成功した。
上記の研究成果は、米国科学振興協会(AAAS)の科学雑誌「Science Advances」に、平成31年4月19日(米国東海岸時間)付けで掲載された。
酵素はタンパク質からなるナノポケットを利用し、狙いとする生体分子を選択的に捕捉することで、続く生理活性や酵素反応を厳密に制御している。この生体系にとって重要な第一段階を人工的に模倣することができれば、特定の生体分子の超高感度な検出法の開発が期待できる。様々な生体分子の中でステロイド性ホルモンは、その構造および機能的な特徴によりアンドロゲン(=男性ホルモン)、プロゲストーゲン(=女性ホルモン)とエストロゲン(=女性ホルモン)に分類される(図1a)。これらの性ホルモンの分子構造は類似しており、主な違いは4つの環状骨格のAとD環上の官能基のみである。生体のタンパク質ポケットは、その微細な構造の違いを厳密に識別できる。しかしながら、人工のかご型やカプセル型分子の内部空間では、比較的大きな性ホルモンを捕捉すること自体が困難であり、また、男女の識別は達成されていなかった。
今回、アンドロゲンレセプター[参考文献1] の約10分の1の大きさの分子カプセル(同グループが開発[参考文献2] ;図1b)が、種々のステロイド性ホルモンを水中で強く捕捉することを見出した。また、詳細な競争実験より、分子カプセルが男性と女性ホルモンの混合物から、男性ホルモン(アンドロゲン)を選択的に捕捉できることを明らかにした。捕捉後の分子カプセルの結晶構造解析から、識別のメカニズムは、カプセル骨格がホルモン構造に誘起されて変形し、分子間相互作用が多点で働くことに起因すると判明した。さらに、蛍光色素を予め捕捉させた分子カプセルを利用することで、水中に溶解する数ナノグラム[用語1]量の男性ホルモンの蛍光検出に成功した。
まず、分子カプセル(図1b)のステロイド性ホルモンに対する捕捉能を調査した。代表的なアンドロゲンのテストステロン(1当量)を分子カプセルの水溶液に添加し60 ℃で10分間加熱撹拌すると、水に難溶なテストステロンは疎水効果[用語2]により定量的にカプセル内に捕捉された。捕捉の事実は1H NMR(プロトン核磁気共鳴装置)およびESI-TOF MS(飛行時間型 質量分析装置)分析で確認した。同様の方法で、代表的なプロゲストーゲンのプロゲステロンとエストロゲンのエストラジオール(図1a)もそれぞれ効率良く分子カプセルに捕捉された。
続いて、競争実験により捕捉の選択性を評価した。分子カプセルの水溶液に対して、上記のテストステロン、プロゲステロン、エストラジオールを1当量ずつ添加し、加熱撹拌した。その結果、テストステロンが98 %以上の選択性で分子カプセルに捕捉されることが判明した(図2a)。その捕捉の強さは、プロゲステロンの100倍以上であった。興味深いことに、この選択性は1当量のテストステロンと大過剰量のプロゲステロンとエストラジオール(それぞれ100当量)を混合した場合でも維持された。
他のステロイド性ホルモンに関して捕捉の競争実験を行った結果、分子カプセルはテストステロンやジヒドロテストステロンやアンドロステロンなどのアンドロゲン(男性ホルモン)に対して、プロゲステロンやヒドロキシプロゲステロンのプロゲストーゲン(女性ホルモン)、エストラジオールやエストリオールのエストロゲン(女性ホルモン)よりも強く捕捉することが判明した(図2b)。すなわち、男性と女性ホルモンを明確に識別できることが明らかになった。また、アンドロゲンの中での捕捉の優先順位では、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオンに続いて、アンドロステロンとなった。得られた捕捉の順序は、性ホルモン自身の水溶性の違いには依存していない。
なぜ、分子カプセルが男性ホルモンを選択的に捕捉できるかを解明するため、テストステロンを含む分子カプセルの単結晶を作製し、そのX線結晶構造解析を行った。その結果、約1 nmサイズのカプセル空間に、同サイズのテストステロンが完全に内包されていることが判明した(図3a、b)。このとき、本来の球状カプセル骨格は、板状のテストステロンに合わせて大きく変形していた。この現象は、柔軟なタンパク質ポケットで見られる誘導適合[用語3]モデルと同様であるが、剛直な人工空間での発現は稀である。この立体構造変化で、分子カプセルを構成する芳香環パネルは、テストステロンのAとD環に最近接し、環上の官能基が多点のCH/OH-π相互作用[用語4]および水素結合していた(図3c)。性ホルモンの構造の差異は、両端のA/D環上の官能基に大きく依存することから、D環がより嵩高いプロゲステロンやA環がより剛直なエストラジオールより、テストステロンがカプセル空間に最も適合したと考えられる。
高感度な男性ホルモンの検出デバイスを志向し、分子カプセル内での分子交換反応を利用した、テストステロンの蛍光センシングに挑戦した。本来、水に不溶なクマリン系色素は分子カプセルに捕捉されると水溶化し、紫外光照射で青緑色に発光する(図4左)[参考文献3]。この水溶液に、約200ナノグラムのテストステロンを含む水溶液を添加すると、テストステロンが優先的に捕捉され、クマリンは放出された。その結果、紫外光照射に対して蛍光が顕著に低下した(図4右)。この蛍光変化は、蛍光光度計でも明確に検出された。男性ホルモンのナノグラムセンシングに成功した。
本研究では、山科研究員、吉沢准教授らのグループが開発した分子カプセルを利用することで、これまで困難であった男性ステロイドホルモンの高選択的な識別を達成した。その識別能は、誘導適合による多点の分子間相互作用に起因し、また、蛍光色素との交換反応で、ナノグラム量の男性ホルモンの蛍光検出に成功した。これらの成果は、性ホルモンの生理活性機構の解明や複雑な生体関連分子の識別を可能とする合成レセプターの設計指針を与えるだけでなく、スポーツ界で問題となっているステロイドのドーピング検出などの超高感度分析への展開も期待できる。
参考文献
[1] K. Pereira de Jésus-Tran, P.-L. Côté, L. Cantin, J. Blanchet, F. Labrie, R. Breton, Protein Sci. 15, 987–999 (2006).
[2] M. Yamashina, Y. Sei, M. Akita, M. Yoshizawa, Nature Commun. 5, 4662 (2014).
[3] M. Yamashina, M. M. Sartin, Y. Sei, M. Akita, S. Takeuchi, T. Tahara, M. Yoshizawa, J. Am. Chem. Soc. 137, 9266–9269 (2015).
用語説明
[用語1] ナノグラム : 1 gの10億分の1の重さ。
[用語2] 疎水効果 : 油と同様の性質をもつ化合物またはその部位が、水中で互いに集合する(引き合う)現象。
[用語3] 誘導適合 : タンパク質のポケットが、対象となる分子(基質)の形状に合わせて構造変化すること。
[用語4] CH/OH-π相互作用 : 炭素または酸素原子上の水素と芳香族化合物の間に働く静電的な相互作用。
論文情報
掲載誌 : |
Science Advances |
論文タイトル : |
A Polyaromatic Receptor with High Androgen Affinity (高いアンドロゲン親和性を有する芳香環レセプター) |
著者 : |
Masahiro Yamashina, Takahiro Tsutsui, Yoshihisa Sei, Munetaka Akita, Michito Yoshizawa |
DOI : |
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准教授 吉沢道人
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